通过琼脂糖凝胶电泳分析少许样品,确认两种
3.分别复溶DNA沉淀于TE(pH8.0)中，浓度约ug/mL.计算DNA的浓度(单位：pmo/mL)时，假定1lbp相当于Da。通过琼脂糖凝胶电泳分析少许样品，确认两种DNA的大概浓度。
4.按方案7中所述将质粒载体DNA去磷酸化。
5.按如下表格将适量的DNA加入到无菌0.5mL微量离心管中：不添加DNA连按酵为了达到最大的连接效率，应在尽可能小的体积(5~10uL)进行反应。
添加ATP作为10X连接缓冲液的组分可以为载体或外源DNA在反应混合物中留出更多的体积。一些商业化的连接酶缓冲液含有ATP.使用这些缓冲液时不必加入ATP。
DNA片段可以和水一起加入管中，然后加热至45C，5min,使DNA片段制备过程中形成的DNA团块解离。将DNA溶液冷却到0C后再添加其余的连接试剂。重要的是：
①加热PEG储液(30%)至室温后再加入连接反应；②最后添加这种成分。在PEG存在时，DNA可以在低温下析出。
6.16C过夜或20C，4h孵育反应混合物。
7.按方案1、2或4中所述的方法，用每个连接反应的稀释液转化感受态大肠杆菌。用已知量的、标准方法制备的超螺旋质粒DNA作为对照检查转化的效率。去除5端磷酸基团能够抑制质粒DNA的自身连接和环化。
在体外连接反应时，只有一个核苷酸带有5-磷酸基团且另-一个带有3-羟基末端时，DNA连接酶才能催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键。